发布时间:05-27 | 作者: | 来源:| 5546:次围观
1.核酸的基础知识
核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）,其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(rRNA),信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）。
DNA主要集中在细胞核内,线粒体和叶绿体中,而RNA主要分布在细胞质当中
核酸中因为嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键,所以核酸具有紫外吸收的特性,DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近,其吸光率以A260表示,在230nm处于吸收低谷,因此可以使用紫外分光光度计对核酸进行定量及定性测定。
核酸为两性电解质,相当于多元酸,可以使用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子,置于电场中向阳极运动,这就是电泳的原理。
2.核酸提取纯化原则和要求
＞保证核酸一级结构的完整性
＞排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）
＞核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子
＞尽可能降低蛋白质、多糖和脂类等大分子物质
3.核酸提取纯化方法
＞酚/氯仿抽提法
1956年发明,通过酚/氯仿处理细胞破碎液或者组织匀浆后,在水相中主要溶解以DNA为主的核酸成分,在有机相中主要是脂类物质,蛋白质位于两相之间。
＞醇沉淀法
乙醇能够消除核酸的水化层,使带负电荷的磷酸基团暴露出来,NA﹢等带正电荷离子能与磷酸基团结合,形成沉淀。
＞层析柱法
通过特殊硅基质吸附材料,能够特定吸附DNA,而RNA和蛋白质顺利通过,然后利用高盐低PH结合核酸,低盐高PH值洗脱,来分离纯化核酸。
＞热裂解碱法
碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离他们,在碱性下,变性蛋白是可溶的。
＞煮沸裂解法
加热处理DNA溶液,利用线性DNA分子的特性,通过离心将DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片形成的沉淀分离。
＞纳米磁珠法
运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性,在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。
＞其他方法
除了上述常用的方法之外,还有超声法、反复冻融法、酶解法及低渗裂解等等多种方法。
4.核酸提取类型
＞总RNA提取
总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA,snoRNA）等组成。
＞miRNA提取
MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子,如小干扰RNAs (siRNAs),通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达,以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
＞基因组DNA提取
进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100～200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。
＞质粒抽提
质粒抽提方法即去除RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。